细胞医学报告
山东光弘生物医药有限公司
2024年05月27日
分离和培养是研究和应用MSC的前两步
干细胞制备，分离和培养
大规模体外培养扩增高质量的MSC，是干细胞企业所追求的。那么建立合适的培养体系就显得非常重要，而培养基是重中之重
分离和培养是研究和应用MSC的前两步。
大规模体外培养扩增高质量的MSC，是干细胞企业所追求的。那么建立合适的培养体系就显得非常重要，而培养基是重中之重。相信有些干细胞企业都有属于自己的培养基专利，但是拥有专利不等于这个专利能培养出高质量的MSC。培养基配方稍加改动，就可以产生新的专利，而且专利的本质不在于追求培养出高品质的MSC。中草药众多、成份复杂多样化，所以在MSC培养基中添加不同的中药材成份，既可产生很多很多专利。
不同的实验或者企业，MSC的培养体系很可能不同。
比如有实验室培养MSC到第9代已经出现80%的衰老（SA-gal染色阳性）[1]，而有的实验室培养到第11代也只是40%的MSC出现衰老[2]。有的实验室骨髓MSC只能扩增到第10代，脐带、脐带血、羊膜来源的MSC也只能扩增到12-14代[3]。但也有实验室能做到脐带MSC的培养能有效扩增到40代，依然具有多向分化潜能[4]。可见不同实验室的培养体系对MSC的扩增效能有明显的差异。
MSC的细胞质量伴随着衰老快速下降
MSC的体外扩增培养，不可避免地出现复制衰老（replicative senescence）[1, 2, 5,6]，过度扩增还可能伴随着基因组的不稳定性[7-9]，影响到MSC的干细胞功能[10]。相对于老鼠的MSC，人MSC的基因组稳定性比较好，而且不具有成瘤性[11-13]。
那么MSC细胞衰老的最直观表现有哪些？增殖速度减慢和胞体变大扁宽是所有细胞衰老的特征[14]。
细胞核型分析显示，骨髓MSC在培养至18代的时候出现了染色体异常和端粒酶缩短[11]，而脐带MSC在培养至30代才会出现染色体异常[13]。但是一般都会应用10代前的MSC，所以不用担心染色体异常的问题。 所以，MSC细胞培养体系很重要！培养基、氧分压和培养载体是三个关键因素。
1. 培养基
基础培养有DMEM、DF-12、αMEM、IMDM等。不同基础培养对MSC大规模扩增有没有影响？目前这方面的研究极少。2018年的一篇文章证明以DMEM为基础的扩增培养基能更好地促进人骨髓MSC在早期传代(P4)中的增殖，但是在P5代后，DMEM就略逊色于αMEM（见下图）[15]。不过，这个培养体系下，只是到P8代，MSC的倍增时间就达到8天，那就说明这个培养体系没法支撑MSC的长期培养，还有优化的空间。
研究关注于补充液对MSC体外培养的影响。
胎牛血清（FBS）是研究实验室中最常见的培养补充液。有专家认为胎牛血清有几个劣势：成本高、批次变异(产生于其1800种蛋白质和4000种代谢物的不同浓度)、可用性有限(只有三分之一的胎牛血清产品符合细胞治疗的监管要求)、各种猪的病毒污染和以及引起异种免疫反应的可能性等等问题[16-18]。因此，2019年的一篇综述认为FBS的使用可能被认为不足以培养临床应用的MSCs[19]。其实，通过多次洗涤的方法，可以将胎牛血清蛋白降到非常低的水平而不足于引发免疫反应。
欧盟2013年有文件《Guideline on the use of bovine serum in the manufacture of human biological medicinal products》规定胎牛血清供应方需要提供安全性检测，关键是不能污染了各种病毒（bluetongue and related orbiviruses、bovine adenovirus、bovine parvovirus、bovine respiratory syncytial virus、bovine viral diarrhoea virus、rabies virus、reovirus 3、bovine viraldiarrhoea virus、bovine polyoma virus等）。
和欧盟的态度一样，美国FDA并不反对胎牛血清的应用。但FDA对胎牛血清的描述就没有欧盟那么具体，只需要保证胎牛血清不能来自疫区，明确提及不能污染口蹄疫病毒和疯牛病病毒。
比如对病毒疫苗的生产就需要用到胎牛血清，FDA官网是这样描述的：“Viral vaccines are produced in living cells, which, similarly, require the addition ofcomplex growth media components, such as fetal calf serum.”fetal calf serum指的就是胎牛血清。
澳大利亚治疗品管理局允许使用FBS生产临床级材料，只要它来自澳大利亚或新西兰等没有疯牛病疫情的国家的牛。
临床对照实验显示MSC临床应用的安全性，MSC治疗不会增加感染的风险，MSC治疗组和对照组在恶液质和成瘤方面没有差异。Meta分析发现MSC治疗与发烧存在一定的关联性，而与其他文献所报道的不良反应没有必要的联系。那么发烧是否与培养基添加胎牛血清有关？有关联，但是胎牛血清不是引起发烧的唯一因素。
为了避免与FBS相关的不良并发症，开发了可替代动物血清的培养基。最常用的是人AB血清(HABS)、人血小板裂解物(HPL)和化学限定培养基(CDM)。
然而，这些替代方案依然存在自身的局限性。HABS和HPL均存在病毒（HIV、HBV、HCV、梅毒等）污染的可能性，而且不同批次之间有明显的差异[20]。成人供者的HABS（血清）在保留MSC重要特性的情况下能否比FBS更能促进MSC增殖的作用是有争议的[21-23]。
比如美国波士顿的塔夫茨-新英格兰医疗中心的研究员发现人HABS在促进脐带MSC增殖方面不如胎牛血清，而且HABS培养脐带MSC容易成团。
人血小板裂解物(HPL)最近成为一种更受欢迎的人类产品，可以代替胎牛血清[22, 24]。血小板在冷冻/解冻过程中被激活，释放多种生长因子，再通过离心以清除血小板小体。获得的生长因子包括血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）、血小板衍生生长因子AB（PDGF-AB）、转化生长因子β1（TGF-β1）、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、血管内皮生长因子（VEGF）等[24, 25]，这些因子以剂量依赖的方式提高了MSC的增殖能力。添加5%的HPL的培养基在克隆形成效率和增殖能力方面优于10%FBS，从而提供了更有效的MSCs扩增[24]。
然而，一些研究显示血小板裂解物的局限性，包括成骨或成脂分化能力降低[26]，以及表面标志表达改变和降低MSC的免疫抑制能力[20]。
此外，蛋白质组学分析表明，从外周血中获得的HPL含有促炎因子CCL3和CCL5，这些因子可能影响MSC的功能[20]。和胎牛血清培养MSC相比，HPL培养的MSC出现免疫抑制功能减弱的情况[20]。
化学限定培养基(CDM)因为不含血清，能避免血清制品带来的潜在风险。常见的CDM有RoosterNourish (Rooster Bio), Mesencult-XF(Stemcell Technologies), StemPro MSC SFM XenoFree (Invitrogen), MSCGM-CD(Lonza)等等。这些培养基中会添加许多生长因子来代替血清的功能，常见的生长因子有：血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）、血小板衍生生长因子AB（PDGF-AB）、转化生长因子β1（TGF-β1）、肝素结合表皮生长因子（HB-β）和胰岛素生长因子-1(IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）等等[27]。也有研究发现这些生长因子能促进MSC增殖的同时，也促进MSC的成骨/成脂/成软骨分化，导致不能很好地维持MSC的干性[28, 29]。
同样，化学成份限定培养基(CDM)也不完美。例如，StemPro MSC SFM（是第一个获得FDA批准的这种类型的商业产品）能促进MSC高表达II类MHC分子HLA-DR，即MSC的免疫原性增高，从而导致免疫系统对MSC的快速清除[30]。也有研究显示化学成份限定培养基STK2能延缓培养过程出现的复制衰老，衰老的MSC明显少于含胎牛血清的DMEM培养基[31]。另外，本小编曾经比较过不同公司的无血清培养对MSC功能的影响，初步发现Corning和Gibco的无血清培养基对MSC的免疫抑制功能没有影响，而MACS、Lonza和R&D公司的无血清培养基均损伤了MSC的免疫抑制能力。
很多MSC培养基配方中喜欢添加地塞米松或同类激素，确实地塞米松能促进MSC的增殖，而且不同浓度的地塞米松对MSC分泌生长因子谱有差异，但是不同浓度的地塞米松均能损伤MSC的免疫[32]。所以，如果打算用MSC来治疗免疫性疾病，那真的不建议用地塞米松来扩增MSC。除非能找到方法抵消地塞米松的这种副作用，只保留其促增殖作用。
2. 氧分压
骨髓间充质干细胞的氧分压约为1-7%[33-35]，而脂肪组织的氧分压为10-15%[36]。骨髓腔血管外的氧分压远远低于动脉血管内的氧分压。因此，在生理上，MSC更适合低氧分压环境。
MSC在低氧（0.5-3%）条件下培养，可通过促进低氧诱导因子（HIF1α）的高表达，激活抗凋亡基因Akt、Bcl2，从而提高MSC输入后的存活能力[37-39]和上调趋化因子受体CXCR4、CX3CR1，增强MSC的归巢能力[40, 41]。
低氧环境能不仅促进细胞增殖，还通过降低caspase-3的酶活性而起抗凋亡作用，并通过增加MSC表达多种生长因子，比如HIFα和HGF等，增强MSC在血管新生方面的功能[42]。
在缺氧条件下培养MSC可提高其增殖能力，并减少培养过程中的自发分化[43]。而且低氧培养MSC并不会对MSC的免疫抑制功能有影响[44]。
但是低氧培养的一个问题，是为了维持低氧的环境，氮气的消耗会非常快，培养成本和管理成本会相应增加一些。
3. 培养载体
虽然有多种生物材料支持MSC的生长，MSC的增殖过程中和生物材料有信息交流。
但是MSC在不同硬度的材料上培养，MSC能感知材料的硬度，从而导致其细胞形状和功能有所差异[45-47]。软质基质上的MSC可促进伤口愈合；相反，硬质基质会降低MSC对伤口的愈合功能，促进瘢痕增生[48, 49]。MSC在微载体上模拟3D培养，也能促进MSC的增殖，而且还能增加MSC表达心脏标志基因（Gata4、NKX2.5、Tnnt2和MYH6）[50]。
到目前为止，许多新的培养材料包括由胶原、糖胺聚糖、甲基丙烯酸透明质酸、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯或海藻酸盐制成的水凝胶，而且都可以制备成不同的硬度，以诱导MSC向某一特定方面培养[51, 52]。
聚-ε-己内酯，一种生物相容性和生物可降解的材料，支持MSC的增殖，同时保持其分化能力和分泌生长因子的功能，而且在这些“微载体”上的细胞可以直接植入体内，而不需要利用酶分离MSC和材料[53]。有趣的是，对温度敏感的聚合物在水溶液中表现出可逆的温度依赖性相变，这是一种独特的特性，可通过外部温度变化来控制MSC和聚合物材料的粘附和解离[54, 55]。基于整合素-肽结合的细胞粘附性、含肽的热敏表面被设计成包含热诱导的“开-关”，这种方法可以实现无胰蛋白酶消化MSC，基本上消除了酶介导的细胞损伤[56]。
在这些生物材料的基础上，MSC可以2D平面培养（最常见的培养瓶或者培养皿），也可以附着在微载体上3D培养，各有利弊，满足不同的需求。科学研究，可以追求漂亮的花式花样。产业化应用，则量力而行，把握好利弊之间的平衡就好。
最后，用一张很好的图来总结目前MSC的生产培养体系！
大规模体外培养扩增高质量的MSC，是干细胞企业所追求的。那么建立合适的培养体系就显得非常重要，而培养基是重中之重。相信有些干细胞企业都有属于自己的培养基专利，但是拥有专利不等于这个专利能培养出高质量的MSC。培养基配方稍加改动，就可以产生新的专利，而且专利的本质不在于追求培养出高品质的MSC。中草药众多、成份复杂多样化，所以在MSC培养基中添加不同的中药材成份，既可产生很多很多专利。
不同的实验或者企业，MSC的培养体系很可能不同。
比如有实验室培养MSC到第9代已经出现80%的衰老（SA-gal染色阳性）[1]，而有的实验室培养到第11代也只是40%的MSC出现衰老[2]。有的实验室骨髓MSC只能扩增到第10代，脐带、脐带血、羊膜来源的MSC也只能扩增到12-14代[3]。但也有实验室能做到脐带MSC的培养能有效扩增到40代，依然具有多向分化潜能[4]。可见不同实验室的培养体系对MSC的扩增效能有明显的差异。
MSC的细胞质量伴随着衰老快速下降
MSC的体外扩增培养，不可避免地出现复制衰老（replicative senescence）[1, 2, 5,6]，过度扩增还可能伴随着基因组的不稳定性[7-9]，影响到MSC的干细胞功能[10]。相对于老鼠的MSC，人MSC的基因组稳定性比较好，而且不具有成瘤性[11-13]。
那么MSC细胞衰老的最直观表现有哪些？增殖速度减慢和胞体变大扁宽是所有细胞衰老的特征[14]。
细胞核型分析显示，骨髓MSC在培养至18代的时候出现了染色体异常和端粒酶缩短[11]，而脐带MSC在培养至30代才会出现染色体异常[13]。但是一般都会应用10代前的MSC，所以不用担心染色体异常的问题。 所以，MSC细胞培养体系很重要！培养基、氧分压和培养载体是三个关键因素。
1. 培养基
基础培养有DMEM、DF-12、αMEM、IMDM等。不同基础培养对MSC大规模扩增有没有影响？目前这方面的研究极少。2018年的一篇文章证明以DMEM为基础的扩增培养基能更好地促进人骨髓MSC在早期传代(P4)中的增殖，但是在P5代后，DMEM就略逊色于αMEM（见下图）[15]。不过，这个培养体系下，只是到P8代，MSC的倍增时间就达到8天，那就说明这个培养体系没法支撑MSC的长期培养，还有优化的空间。
研究关注于补充液对MSC体外培养的影响。
胎牛血清（FBS）是研究实验室中最常见的培养补充液。有专家认为胎牛血清有几个劣势：成本高、批次变异(产生于其1800种蛋白质和4000种代谢物的不同浓度)、可用性有限(只有三分之一的胎牛血清产品符合细胞治疗的监管要求)、各种猪的病毒污染和以及引起异种免疫反应的可能性等等问题[16-18]。因此，2019年的一篇综述认为FBS的使用可能被认为不足以培养临床应用的MSCs[19]。其实，通过多次洗涤的方法，可以将胎牛血清蛋白降到非常低的水平而不足于引发免疫反应。
欧盟2013年有文件《Guideline on the use of bovine serum in the manufacture of human biological medicinal products》规定胎牛血清供应方需要提供安全性检测，关键是不能污染了各种病毒（bluetongue and related orbiviruses、bovine adenovirus、bovine parvovirus、bovine respiratory syncytial virus、bovine viral diarrhoea virus、rabies virus、reovirus 3、bovine viraldiarrhoea virus、bovine polyoma virus等）。
和欧盟的态度一样，美国FDA并不反对胎牛血清的应用。但FDA对胎牛血清的描述就没有欧盟那么具体，只需要保证胎牛血清不能来自疫区，明确提及不能污染口蹄疫病毒和疯牛病病毒。
比如对病毒疫苗的生产就需要用到胎牛血清，FDA官网是这样描述的：“Viral vaccines are produced in living cells, which, similarly, require the addition ofcomplex growth media components, such as fetal calf serum.”fetal calf serum指的就是胎牛血清。
澳大利亚治疗品管理局允许使用FBS生产临床级材料，只要它来自澳大利亚或新西兰等没有疯牛病疫情的国家的牛。
临床对照实验显示MSC临床应用的安全性，MSC治疗不会增加感染的风险，MSC治疗组和对照组在恶液质和成瘤方面没有差异。Meta分析发现MSC治疗与发烧存在一定的关联性，而与其他文献所报道的不良反应没有必要的联系。那么发烧是否与培养基添加胎牛血清有关？有关联，但是胎牛血清不是引起发烧的唯一因素。
为了避免与FBS相关的不良并发症，开发了可替代动物血清的培养基。最常用的是人AB血清(HABS)、人血小板裂解物(HPL)和化学限定培养基(CDM)。
然而，这些替代方案依然存在自身的局限性。HABS和HPL均存在病毒（HIV、HBV、HCV、梅毒等）污染的可能性，而且不同批次之间有明显的差异[20]。成人供者的HABS（血清）在保留MSC重要特性的情况下能否比FBS更能促进MSC增殖的作用是有争议的[21-23]。
比如美国波士顿的塔夫茨-新英格兰医疗中心的研究员发现人HABS在促进脐带MSC增殖方面不如胎牛血清，而且HABS培养脐带MSC容易成团。
人血小板裂解物(HPL)最近成为一种更受欢迎的人类产品，可以代替胎牛血清[22, 24]。血小板在冷冻/解冻过程中被激活，释放多种生长因子，再通过离心以清除血小板小体。获得的生长因子包括血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）、血小板衍生生长因子AB（PDGF-AB）、转化生长因子β1（TGF-β1）、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、血管内皮生长因子（VEGF）等[24, 25]，这些因子以剂量依赖的方式提高了MSC的增殖能力。添加5%的HPL的培养基在克隆形成效率和增殖能力方面优于10%FBS，从而提供了更有效的MSCs扩增[24]。
然而，一些研究显示血小板裂解物的局限性，包括成骨或成脂分化能力降低[26]，以及表面标志表达改变和降低MSC的免疫抑制能力[20]。
此外，蛋白质组学分析表明，从外周血中获得的HPL含有促炎因子CCL3和CCL5，这些因子可能影响MSC的功能[20]。和胎牛血清培养MSC相比，HPL培养的MSC出现免疫抑制功能减弱的情况[20]。
化学限定培养基(CDM)因为不含血清，能避免血清制品带来的潜在风险。常见的CDM有RoosterNourish (Rooster Bio), Mesencult-XF(Stemcell Technologies), StemPro MSC SFM XenoFree (Invitrogen), MSCGM-CD(Lonza)等等。这些培养基中会添加许多生长因子来代替血清的功能，常见的生长因子有：血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）、血小板衍生生长因子AB（PDGF-AB）、转化生长因子β1（TGF-β1）、肝素结合表皮生长因子（HB-β）和胰岛素生长因子-1(IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）等等[27]。也有研究发现这些生长因子能促进MSC增殖的同时，也促进MSC的成骨/成脂/成软骨分化，导致不能很好地维持MSC的干性[28, 29]。
同样，化学成份限定培养基(CDM)也不完美。例如，StemPro MSC SFM（是第一个获得FDA批准的这种类型的商业产品）能促进MSC高表达II类MHC分子HLA-DR，即MSC的免疫原性增高，从而导致免疫系统对MSC的快速清除[30]。也有研究显示化学成份限定培养基STK2能延缓培养过程出现的复制衰老，衰老的MSC明显少于含胎牛血清的DMEM培养基[31]。另外，本小编曾经比较过不同公司的无血清培养对MSC功能的影响，初步发现Corning和Gibco的无血清培养基对MSC的免疫抑制功能没有影响，而MACS、Lonza和R&D公司的无血清培养基均损伤了MSC的免疫抑制能力。
很多MSC培养基配方中喜欢添加地塞米松或同类激素，确实地塞米松能促进MSC的增殖，而且不同浓度的地塞米松对MSC分泌生长因子谱有差异，但是不同浓度的地塞米松均能损伤MSC的免疫[32]。所以，如果打算用MSC来治疗免疫性疾病，那真的不建议用地塞米松来扩增MSC。除非能找到方法抵消地塞米松的这种副作用，只保留其促增殖作用。
2. 氧分压
骨髓间充质干细胞的氧分压约为1-7%[33-35]，而脂肪组织的氧分压为10-15%[36]。骨髓腔血管外的氧分压远远低于动脉血管内的氧分压。因此，在生理上，MSC更适合低氧分压环境。
MSC在低氧（0.5-3%）条件下培养，可通过促进低氧诱导因子（HIF1α）的高表达，激活抗凋亡基因Akt、Bcl2，从而提高MSC输入后的存活能力[37-39]和上调趋化因子受体CXCR4、CX3CR1，增强MSC的归巢能力[40, 41]。
低氧环境能不仅促进细胞增殖，还通过降低caspase-3的酶活性而起抗凋亡作用，并通过增加MSC表达多种生长因子，比如HIFα和HGF等，增强MSC在血管新生方面的功能[42]。
在缺氧条件下培养MSC可提高其增殖能力，并减少培养过程中的自发分化[43]。而且低氧培养MSC并不会对MSC的免疫抑制功能有影响[44]。
但是低氧培养的一个问题，是为了维持低氧的环境，氮气的消耗会非常快，培养成本和管理成本会相应增加一些。
3. 培养载体
虽然有多种生物材料支持MSC的生长，MSC的增殖过程中和生物材料有信息交流。
但是MSC在不同硬度的材料上培养，MSC能感知材料的硬度，从而导致其细胞形状和功能有所差异[45-47]。软质基质上的MSC可促进伤口愈合；相反，硬质基质会降低MSC对伤口的愈合功能，促进瘢痕增生[48, 49]。MSC在微载体上模拟3D培养，也能促进MSC的增殖，而且还能增加MSC表达心脏标志基因（Gata4、NKX2.5、Tnnt2和MYH6）[50]。
到目前为止，许多新的培养材料包括由胶原、糖胺聚糖、甲基丙烯酸透明质酸、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯或海藻酸盐制成的水凝胶，而且都可以制备成不同的硬度，以诱导MSC向某一特定方面培养[51, 52]。
聚-ε-己内酯，一种生物相容性和生物可降解的材料，支持MSC的增殖，同时保持其分化能力和分泌生长因子的功能，而且在这些“微载体”上的细胞可以直接植入体内，而不需要利用酶分离MSC和材料[53]。有趣的是，对温度敏感的聚合物在水溶液中表现出可逆的温度依赖性相变，这是一种独特的特性，可通过外部温度变化来控制MSC和聚合物材料的粘附和解离[54, 55]。基于整合素-肽结合的细胞粘附性、含肽的热敏表面被设计成包含热诱导的“开-关”，这种方法可以实现无胰蛋白酶消化MSC，基本上消除了酶介导的细胞损伤[56]。
在这些生物材料的基础上，MSC可以2D平面培养（最常见的培养瓶或者培养皿），也可以附着在微载体上3D培养，各有利弊，满足不同的需求。科学研究，可以追求漂亮的花式花样。产业化应用，则量力而行，把握好利弊之间的平衡就好。
最后，用一张很好的图来总结目前MSC的生产培养体系！